وبلاگ

پاپائیک هضم شده از مواد سویابین

۳ g

سدیم کلراید

۵ g

فسفات دی پتاسیم

۲٫۵ g

دکستروز

۲٫۵ g

۳-۲-۵٫ محیط تیوگلیکولات براث^[۱۲۳]
این آبگوشت غنی به طور معمول درآزمایشگاه های میکروب شناسی عموماً برای تست های استریلیتی در تشخیص باکتری های بی هوازی مورداستفاده بوده است. مقدار آگار موجود در محیط تیوگلیکولات ۰۷۵/۰ درصد بوده و این مقدار آگار جهت جلوگیری از ورود جریان اتمسفر حاوی اکسیژن به داخل آبگوشت استفاده شده است. تیوگلیکولیک اسید به عنوان یک عامل احیاء کننده جهت پایین آوردن پتانسیل اکسیداسیون احیاء درمحیط استفاده شده است. با اضافه نمودن تعداد زیادی از فاکتورهای مغذی مانند کازئین، عصاره مخمر، گوشت و ویتامین‌ها به این محیط، رشد اکثر باکتریهای پاتوژن تشدید گردید. سایر مکمل‌های غذایی، اندیکاتور اکسیداسیون- احیاء (Resazorin)، دکستروز، ویتامین K₁ و هِمین (hemin) در فرمول های تغییر یافته دیگر به محیط اضافه شده است. در این محیط می‌توان تفاوت بین انتشار باکتری ها درمحیط را مشاهده نمود . باسیل‌های گرم منفی اختیاری در سراسر محیط پخش شده، کوکسی‌های گرم مثبت به صورت توپ بادکرده (puff ball) رشد کرده و هوازی های مطلق مانند سودوموناس و مخمرها به صورت یک لایه نازک در سطح آگار رشد می‌نمایند. جهت رشد باکتری های بی هوازی اگر به محیط تیوگلیکولات مکمل هِمین (hemin) به مقدار ۵ میکروگرم در میلی لیتر و ویتامین k₁ به میزان ۱/۰ میکروگرم در میلی لیتر و بیکربنات سدیم به میزان ۱ میلی گرم درمیلی لیتر اضافه گردد نتایج بهتری حاصل خواهد شد. از محیط تیوگلیکولات به منظور انجام تست استریلیتی سوسپانسیون های سیاه سرفه استفاده گردید.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۳٫ روش کار :
۳-۳-۱٫ انتخاب سویه های بوردتلاپرتوسیس
در این پروژه از سویه‌ی ۵۰۹ با شماره بچ های EXMG89-2 ،EXB89-5 ،EXB89-17 ، EXB89-12 ، EXB89-11 و EXB89-6 و سویه ۱۳۴ با شماره بچ های EXMG89-1 ، EXB89-16 ، EXB89-14 ، EXB89-13 ، EXB89-7 وEXB89-3 برای تولید واکسن سیاه سرفه استفاده گردید. این دو سویه‌ از منابع معتبر برای تولید واکسن تأمین شدند.
۳-۳-۱-۱٫ لیوفیلیزه کردن^[۱۲۴]
باکتری رشد یافته سیاه سرفه در محیط بورده ژانگو و یا محیط مایع با حداقل پاساژ پس از جداسازی از محیط کشت به میزان مناسب با شیر پس چرخ^[۱۲۵] مخلوط شده و در آمپول های شیشه ای مخصوص تقسیم گردیدند، سپس آمپول های محتوی باکتری در دستگاه فریز درایر قرار داده شدند تا پس از ۴۸ ساعت محتویات آمپول تحت شرایط خلاء در سرما فریز گردد. پس از آن، آمپول ها درب بندی شده و در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد و یا در دمای ۴-۲ درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری گردید. هر چه دمای محل نگهداری پایین تر باشد مدت زمان نگهداری سویه های واکسینال بیشتر می شود.
۳-۳-۲٫ کشت باکتری سیاه سرفه
۳-۳-۲-۱٫ کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو^[۱۲۶]
به منظور بدست آوردن بذر کافی برای تلقیح به فرمانتور باکتری سیاه سرفه روی محیط کشت استارتر تجدید حیات شد. به این منظور یک آمپول از بذر لیوفیلیزه باکتری سیاه سرفه بر روی محیط کشت بورده ژانگو حاوی خون کشت داده شد. پس از انکوباسیون محیط کشت به مدت ۷۲-۴۸ ساعت از باکتری تست های میکروسکوپیک با بهره گرفتن از سوش رنگ آمیزی گرم بعمل آمد تا در صورت خالص بودن در مراحل بعدی مورد استفاده قرار گیرد.
اپتیمم مقدار مایه تلقیحی که برای کشت فرمانتوری لازم بود تعداد مراحل کشت دادن مقدماتی را تعیین کرد. بطور کلی مقدار بذر لازم برای تلقیح حدود % ۳-۱/۰ بود.
۳-۳-۲-۲٫ کشت بذر روی محیط وروی^[۱۲۷]
سلول باکتری سیاه سرفه رشد یافته بچ های شماره یEXMG89-1 ، EXB89-16 ، EXB89-14 ، EXB89-13،EXB89-7 وEXB89-3 از سویه ۱۳۴و بچ های شماره یEXMG89-2 ،EXB89-5 ، EXB89-17 ، EXB89-12 ، EXB89-11 وEXB89-6 از سویه ۵۰۹ بر روی محیط بورده ژانگو حاوی خون گوسفند پس از اطمینان از خلوص از محیط جامد شستشو داده شد و به محیط مایع وروی منتقل گردید. باکتری برای رشد روی این محیط در شیکر انکوباتور در ۳۵ درجه سانتیگراد بمدت ۴۸-۲۴ ساعت رشد داده شد و پس از اطمینان از خلوص کشت با بهره گرفتن از روش رنگ آمیزی گرم، بذر مذکور برای انجام کشت در فرمانتور مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۳-۲-۳٫ مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه
۳-۳-۲-۳-۱٫ استریلیزاسیون فرمانتور^[۱۲۸]
در این تحقیق برای کشت فرمانتوری سیاه سرفه از فرمانتورNovo paljas به حجم ۵۰ لیتر استفاده شد که در ابتدا با آب مقطر تا سطح معینی پر شد، سپس با گردش بخار در داخل Heating coil آب به درجه حرارت ۱۱۰رسیده و تحت فشار ۵/۰ بار به مدت ۳۰ دقیقه فرمانتور استریل شد. کلیه شرایط لازم برای استریلیزاسیون فرمانتور توسط پانل کنترل به صورت نیمه اتوماتیک کنترل گردید.
شکل۳-۱٫ فرمانتور استفاده شده برای کشت سیاه سرفه
۳-۳-۲-۳-۲٫ آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری
محیط پایه Modified B₂ با اسیدیته حدود ۱/۷ پس از عبور از سیستم فیلتراسیون (۲۲/۰میکرون) وارد فرمانتور استریل شد، پس از آن مکمل محیط شامل فاکتورهای رشد و ویتامین های ضروری بصورت محلول با نسبت معین با بهره گرفتن از مجاری تزریق به صورت استریل به محیط پایه اضافه گردید، سپس دور موتور فرمانتور را افزایش داده تا محیط پایه و مکمل بخوبی با یکدیگر مخلوط گردند. قبل از تلقیح بذر به فرمانتور pH محیط با بهره گرفتن از اسید و باز استریل درpH بهینه که عدد ۱/۷-۷ می باشد، تنظیم گردید. پس از آن OD محیط کشت در طول موج ۵۳۰ و ۵۹۰ نانومتر با بهره گرفتن از اسپکتوفتومترExternal اندازه گیری شده و در مدارک مربوطه ثبت گردید.
۳-۳-۲-۳-۳٫ تلقیح بذر به محیط کشت درفرمانتور
بذر ۴۸-۲۴ساعته بوردتلا پرتوسیس بچ های شماره یEXMG89-1 ، EXB89-16 ،EXB89-14 ، EXB89-13، EXB89-7 وEXB89-3 از سویه ۱۳۴ و بچ های شماره ی EXMG89-2 ،EXB89-5 ،EXB89-17 ، EXB89-12 ، EXB89-11 و EXB89-6 از سویه ۵۰۹ که قبلاً در شیشه های مناسب همراه با ست تزریق آماده سازی شده بود بصورت استریل به فرمانتور نصب و سپس با بهره گرفتن از مجاری تزریق به داخل فرمانتور حاوی محیط کشت کامل B₂ تزریق گردید. عملیات کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه به مدت ۴۲-۳۸ ساعت به طول انجامید و در طی آن شرایط محیطی رشد باکتری در فرمانتور نظیر pH، دمای رشد، میزان OD، دور همزن، میزان هوادهی(جریان هوای ورودی به دستگاه) و فشار داخلی فرمانتور ثبت شده و تحت کنترل دقیق قرار گرفت. بعلاوه به وسیله گرفتن اسمیر با فواصل چهار ساعت یکبار خلوص کشت در طول دوره کشت باکتری درون فرمانتور مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۳-۳٫ جداسازی باکتری سیاه سرفه ازمحیط کشت
پس از اتمام دوره رشد باکتری، محیط کشت حاوی سلول های باکتری از فرمانتور تخلیه گردید. در این پروژه از دو روش مختلف جداسازی با بهره گرفتن از سانتریفوژ و جداسازی با بهره گرفتن از سیستم میکروفیلتراسیون استفاده گردید که در زیر به تفصیل ارائه شده است :
۳-۳-۳-۱٫ جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سانتریفوژ
پس از پایان دوره کشت، محصول بدست آمده از طریق یکی از لوله های خروجی فرمانتور در ظرف ۴۵ لیتری بصورت استریل تخلیه گردید. سپس با بهره گرفتن از سانتریفوژ یخچال دار مدل Beckman با سرعت ۸ هزار دور در دقیقه بمدت ۳۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد سلول باکتری سیاه سرفه از سوپرناتانت جداسازی شد.
برای جمع آوری جرم باکتری ازPBS استریل و خنک با اسیدیته حدود۲/۷ استفاده گردید. باکتری استحصال شده بصورت سوسپانسیون با غلظت Iou/ml 150-100 جمع آوری گردید.
۳-۳-۳-۲٫ جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سیستم میکروفیلتراسیون
این عمل با بهره گرفتن از سیستم میکروفیلتراسیون سارتوریوس (Sartorius) توسط کاست هایی با سایز ۴۵/۰ میکرون صورت گرفت. ابتدا دستگاه با کاست فوق بسته شده و پس از شستشوی کامل با سرم فیزیولوژی با بهره گرفتن از بخار تمیز استریل شد. سپس مقدار ۴۰ لیتر محیط کشت حاوی باکتری تحت فیلتراسیون قرار گرفته و سلول­های باکتری سیاه سرفه از محیط کشت آن بصورت سوسپانسیونی غلیظ جداسازی گردید. سپس این سوسپانسیون با بهره گرفتن از PBS خنک و استریل در محدوده Iou/ml 150-100 از نظر غلظت تنظیم گردید.