وبلاگ

پس از سرد شدن محصول در دمای اتاق، ۲۰ میلی­­لیتر از مالاشیت گرین اتوکلاو شده و تازه تهیه شده به آن اضافه ­گردید.
برای تهیه این محیط از تخم مرغ­های تازه­ای که بیشتر از یک هفته از عمر آن نگذشته بود، استفاده گردید. ابتدا با یک برس و یک محلول صابونی ۵ درصد روی پوسته تخم مرغ ها کاملا” سائیده شد تا تمیز گردند، سپس تخم مرغ­ها در محلول صابونی ۵ درصد به مدت ۳۰ دقیقه غوطه ور گردیدند. بعد از شستشو با آب، از اتانول ۷۰ درصد برروی تخم مرغ­ها اسپری گردید و به مدت ۱۵ دقیقه تخم مرغ­ها در این وضعیت قرار گرفتند. بعد از شستشو و ضد عفونی کردن دستها با الکل ۷۰ درصد محتویات تخم مرغ را یکی یکی داخل فلاسک استریل شکسته و با تکان­های دست یکنواخت و هموژنیزه ­شدند. تخم مرغ­های هموژنیزه را با یک گاز ۴ لایه استریل فیلتر کرده و داخل یک ارلن استریل ریخته ­شد سپس ۱۰۰۰ میلی­لیتر از تخم مرغ به محلول تهیه شده اضافه گردید.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

مخلوط حاصل با دست تکان داده شد و برای اختلاط کامل، از دستگاه همزن استفاده گردید.
در شرایط استریل مقدار ۶ الی ۸ میلی­لیتر از محیط کشت در لوله­های آزمایش در پیچ­دار ریخته ­شد و محیط­ها در دستگاه پخت محیط یا کواگولاتور بصورت Slant (شیب دار و مایل) قرار گرفتند تا به مدت ۵۰ دقیقه در دمای ۸۵ درجه سانتی ­گراد پخته شوند.
محیط­های آماده و پخته شده به مدت ۴۸ ساعت با در نیمه باز (شل) جهت کنترل در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرار ­گرفت، در صورت عدم آلودگی درب لوله­ها محکم ­گردید.
۳-۲-۳. آلودگی­زدایی و تغلیظ نمونه­ها
برای آلودگی­زدایی نمونه­ها از روش N - استیل-L - سیستئین – هیدروکسید سدیم (NaOH-NALC) استفاده ­گردید.
اصولا هیدروکسید سدیم، یک ماده آلودگی­زدای شدیدا سمی می­باشد، که بعنوان یک امولسیون کننده هم عمل می­ کند. افزودن ماده موکولیتیک N - استیل-L - سیستئین (NALC) ، غلضت هیدروکسید سدیم را کاهش داده و زمان لازم برای عمل آلودگی­زدایی را کوتاه می­ کند. بنابراین در به دست آوردن اکثر، باسیل مقاوم به اسید کمک می­ کند .(Forbes B.A and Hicks K., 1993)
مواد مورد نیاز
محلول­های سیترات سدیم (۹/۲ % یا ۱/۰ نرمال)
سود (۴% یا ۱ نرمال)
بافر فسفات ۰۶۸/۰ مولار با ۸/۶ pH= : که مخلوطی به میزان مساوی از محلول­های Na₂HPO₄ و KH₂PO₄ است.
محلول NaOH-NALC : که مخلوطی از سیترات سدیم، سود و NALC است که تازه استفاده می­ شود.
۳-۲-۳-۱. آماده ­سازی محلول­ها
تهیه سیترات سدیم ۹/۲ درصد (۱/۰ مولار)
۴/۲۹ گرم سیترات سدیم بدون آب به یک لیتر آب مقطر استریل اضافه ­شد و ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو ­گردید.
تهیه سدیم هیدروکسید ۴ درصد (یک نرمال)
۴۰ گرم سود در مقدار کمی آب مقطر حل ­شد، حجم نهایی به ۱ لیتر ­رسید.
در مرحله بعد ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو ­گردید.
در صورت مشاهده هر نوع کدورت و اشکال توده­ای، محلول غیر قابل استفاده خواهد بود.
بافر فسفات ۰۶۷/۰ مولار pH=6/8
استوک قلیایی: برای تهیه دی سدیم فسفات ۱۵ مولار (Na₂HPO₄) در یک فلاسک مدرج ۴۷/۹ گرم Na₂HPO₄ بدون آب اضافه ­شد سپس با کمی آب مقطر حل ­گردید و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر ­رسید.
استوک اسیدی: برای تهیه مونو پتاسیم فسفات ۱۵ مولار (KH₂PO₄) در یک فلاسک مدرج ۰۷/۹ گرم KH₂PO₄ اضافه ­شد سپس با کمی آب مقطر حل گشته و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر ­رسید.
به میزان مساوی از هر دو استوک با یکدیگر مخلوط ­شد و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد بمدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو ­گردید.
۳-۲-۴. روش کار کشت
در یک لوله سانتریفوژ ۵۰ میلی­لیتری یک حجم از محلول NaOH-NALC به حجم مساوی از نمونه اضافه ­گردید.
در مرحله بعد لوله­ها توسط ورتکس مخلوط ­شد (زمان اختلاط نباید از ۳۰ ثانیه بیشتر می­شد زیرا NALC در حضور اکسیژن ناپایدار بوده و فعالیت خود را از دست می­داد).
لوله­ها جهت عمل دکانتامیناسیون (۲۰ الی ۲۵ درجه سانتی ­گراد) به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار ­گرفتند.
پس از سپری شدن زمان مذکور، مخلوط با آب مقطر استریل یا بافر فسفات به حجم نهایی ۵۰ میلی لیتر ­رسید (با این رقیق سازی، عمل NaOH متوقف شده و از چسبندگی و ویسکوزیته مخلوط کاسته می­ شود).
در لوله­ها محکم بسته ­شد، چند بار وارونه ­گردید تا محتویات داخل لوله­ها کاملا” مخلوط و یکنواخت گردند.
لوله­ها در rpm 3000 به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه سانتریفوژ ­شدند.
مایع رویی به یک ظرف محتوی محلول آلوده­زدا حاوی یک ماده ضدعفونی کننده نظیر فنل ۵ درصد منتقل ­گردید.
به رسوب حاصل، بافر فسفات اضافه ­شد و توسط پی­پت پاستور استریل قسمتی از رسوب را برداشته به محیط کشت انتقال داده شد.
باقیمانده رسوب را روی لام برده، یک گسترش به طول ۱ تا ۲ سانتی­متر ایجاد ­گردید.
نمونه­­ها در ۴ لوله حاوی محیط لونشتاین جانسن دارای گلیسرول و لونشتاین جانسن بدون گلیسرول دارای پیرووات کشت داده ­شد. (۲ لوله قبل از عمل دکانتامینه و ۲ لوله بعد از عمل دکانتامینه) درب لوله­ها را نیم پیچ باز ­گذاشته سپس لوله­ها را در انکوباتور۳۷ درجه قرار داده بعد از دو هفته درب لوله­ها را سفت کرده و به مدت ۲ ماه در ۳۷ درجه سانتی ­گراد نگهداری کرده و هر هفته لوله­ها بررسی ­شدند.
۳-۲-۴-۱. محیط کشت حاوی تیوفن ۲- کربوکسیلیک اسید هیدرازید
این محیط کشت جهت افتراق M. bovis ازM. tuberculosis می­باشد، که M. bovis قادر به رشد در این محیط نمی ­باشد.
۵/۲ گرم از پودر تیوفن ۲- کربوکسیلیک اسید هیدرارید به ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر اضافه ­شد و غلظت ۵/۲% آن تهیه ­گردید و ۲۰۰ میکرولیتر از استوک ۵/۲% به ۲۰۰ میلی­لیتر از محیط کشت اضافه ­شد و غلظت آن در محیط کشت به ۵/۲ میکروگرم بر میلی­لیتر ­­رسید.
۳-۳. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریوم­ها
۳-۳-۱. تهیه گستره
از رسوب مایعات استریل بدن، قبل و بعد از یکنواختی و آلودگی­زدایی ابتدا گستره میکروسکوپی تهیه شد بنحوی که یک اسمیر (گسترش)، با پخش کردن حدود ۱/۰ سی­سی از نمونه مورد نظر بر روی منطقه­ای با ابعاد تقریبی ۱×۲ سانتی­متر از یک اسلاید (لام) شیشه ­ای نو، تمیز و برچسب خورده میکروسکوپی در هنگام کشت تهیه گردید. گستره تهیه شده پس از خشک شدن در هوای آزمایشگاه به وسیله حرارت (۸۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه) ثابت ­شد.
سپس با روش فلورئوکروم اورامین _ رودامین رنگ­­آمیزی شد و به وسیله میکروسکوپ فلورسانس با ابژکتیو پایین و خشک مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۳-۲. رنگ­آمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O
مواد مصرفی: اورامین O ،اتانول ۹۵ درصد، فنل کریستال، اسید کلریدریک غلیظ، رد تیازین، آب مقطر
آماده سازی مواد
اورامین O : 1/0 گرم از اورامین O در ۱۰ میلی­لیتر اتانول ۹۵ درصد حل گردید.
فنل: ۳ گرم فنل کریستال در ۸۷ میلی­­لیتر آب مقطر حل ­شد.
دو محلول بالا با هم مخلوط ­شدند.
اسید الکل: با دقت ۵/۰ میلی­لیتر اسید هیدروکلراید غلیظ را به ۱۰۰ میلی­لیتر اتانول ۷۰ درصد افزوده سپس به آرامی مخلوط ­گردیدند.
رد تیازین: ۱ گرم رد تیازین همرا با ۵۰ میلی لیتر فنل و ۱۰۰ میلی­لیتر اتانول در ۸۵۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­شد.
مراحل رنگ­آمیزی
سطح اسیمر از محلول اورامین لبریز ­گردید و اجازه داده ­شد تا ۱۵ دقیقه رنگ با گسترش تماس داشته باشد.
لام با آب مقطر شسته ­شد سپس در ظرف اسید الکل به مدت ۲-۳ دقیقه قرار داده ­شد تا کاملا” رنگ بری صورت گیرد.
مجددا” اسمیر شسته و خشک گردید.