وبلاگ

۵-۱- کلیات
توسعه زیست حسگرهای الکتروشیمیایی تا حد زیادی به الکترود کار مناسب در ساختار آن بستگی دارد. در میان الکترودهای کار مختلف، الکترود خمیر کربن (CPE)، ساده­ترین و پرکاربردترین است. در بسیاری از موارد، خمیرکربن را می­توان به راحتی با مواد مختلفی اصلاح کرد تا کارایی آن بهبود یابد. در سال­های اخیر تلاش های زیادی برای طراحی زیست حسگرهای الکتروشیمیائی DNA با بهره گرفتن از نانوذرات نیز، صورت گرفته که نسبت به سایر زیست حسگرها کارائی بالاتری دارند. نانوذرات _۲SiO به خاطر خواص منحصر به فرد خود، از جمله: پایداری بالا، سمیت کم، سازگاری خوب، آماده سازی آسان محیط مناسبی برای تثبیت مولکول­های زیستی هستند، در حالی که فعالیت زیستی این مولکول ها حفظ می شود [۱۰۱]. استفاده از این نانوذرات در پیکره­ی خمیر کربن، سبب افزایش رسانایی سطح الکترود اصلاح شده و در نتیجه، موجب افزایش پاسخ الکتروشیمیایی مورد نظر می­گردد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۵-۲- اهمیت ساختار i-motif DNA
به دلیل اهمیت ساختار i-motif -DNA­در سلول­های بدن انسان و اهمیت زیاد این ساختار در بلوکه کردن انتهای تلومرها و مهار آنزیم تلومراز و همچنین بیماری­های ناشی از سرطانی شدن سلول­ها، مطالعه این نوع ساختارهای DNA مورد توجه قرار گرفته است [۱۰۲]. ترکیباتی که با توالی­های ذکر شده پایداری ایجاد کنند، قادر به مهارکردن فعالیت تلومراز می­باشند. پایداری ساختارi-motif به تکرار توالی دارای سیتوزین، pH اسیدی ملایم، ماهیت و غلظت کاتیون های موجود در محلول بستگی دارد [۱۰۳]. پایداری ساختار i-motif پیچ خورده در pH اسیدی ملایم، یک استراتژی خوب برای درمان سرطان است، چون می ­تواند از واکنش تلومراز در سلول سرطانی جلوگیری ­کند.
مراحل انجام آزمایش در این کار تحقیقاتی، به اختصار به شرح زیر بیان می­ شود:
الف) پیش تیمار الکتروشیمیایی^[۷۴] الکترودها: پس از آماده‌سازی الکترودهای خمیر کربن، این الکترودها قبل از استفاده باید فعالسازی گردد. پیش­تیمار الکتروشیمیایی معمولاً برای فعال­سازی سطح الکترود کار به کار می­رود .بدین منظور، CPE درون محلول بافر استات M5_/0 (8_/4 =pH) حاوی NaCl M1_/0 قرار داده شده و پتانسیل V 8_/1+ نسبت به الکترود مرجع به مدت ۵ دقیقه به آن اعمال گردید.
ب) تثبیت ساختار i-motif DNA بر روی سطح الکترود: پس از مرحله پیش فعالسازی، به منظور تثبیت ساختارDNA i-motif بر روی سطح الکترود اصلاح شده، الکترود به درون سل الکتروشیمیایی شامل محلولی از فسفات mM 100، _۲ mM MgCl0_/1، M NaCl 5_/1، μM i-motif 0_/1، ۵_/۴pH= وارد شده و پتانسیل V5_/0+ نسبت به الکترود شاهد برای ۵ دقیقه به آن اعمال می­گردد. تثبیت DNA بر روی سطح الکترود اصلاح شده با نانو ذرات _۲SiO (₂NSiO)، یک چالش بزرگ است. این مشکل در بعضی موارد در حضور ^+۲Mg حل شده است. افزودن _۲MgCl به محلول بافر، خاصیت چسبندگی DNA را بر روی سطح الکترود بهبود می­بخشد به دلیل اینکه یون ^+۲Mg به بار منفی فسفات در DNA متصل شده و می ­تواند مانند پلی بین DNA و سطح الکترود اصلاح شده عمل کند. اسید آمینه –L سیستئین نیز به منظور بهبود خاصیت چسبندگی DNA بر روی سطح الکترود خمیر کربن افزوده شد. اسید آمینه L- سیستئین مقاومت نانو ذرات _۲SiO برای تثبیت DNA را کاهش داده و تثبیت DNA در این سطح بهتر انجام می­ شود. نمایش نموداری مراحل تهیه زیست حسگر الکتروشیمیایی فوق در شکل ۵-۱، ارائه شده است.
شکل ۵-۱- تصویر نموداری از مراحل تهیه زیست حسگر الکتروشیمیایی i-motif DNA.
ج) مرحله برهم­کنش با داروی تاموکسیفن: پس از تثبیت i-motif DNA بر روی الکترودکار، آن را کاملاً با آب مقطر یون زدایی شده آبکشی کرده و در محلول دارو با غلظت­های مختلف به مدت ۱۵ دقیقه شناور کرده­ایم و سپس الکترود را از محلول خارج کرده و با آب مقطر یون­زدایی شده آبکشی کرده و ثبت بررسی­
های الکتروشیمیایی مورد استفاده قرار گرفت.
د) مطالعات الکتروشیمیایی با روش­های ولتامتری چرخه­ای و ولتامتری پالس موج مربعی^[۷۵] (SWV) در محلول بافر فسفات M 1_/0 با ۵_/۴ pH= دارای نمک NaClبا غلظت M 1_/0 انجام شده است.
۵-۳- ویژگی­های CPE/₂NSiO / i-motif DNA:
برای مطالعه ویژگی­های زیست­ حسگر الکتروشیمیایی (CPE/₂NSiO/ i-motif DNA) از روش­های مختلف استفاده شده است که در زیر به آنها می­پردازیم.
۵-۳-۱- ریخت شناسی سطح الکترودهای کار
برای بررسی ریخت شناسی سطح الکترودها و مراحل مختلف ساخت زیست­ حسگر الکتروشیمیایی فوق از تصویربرداری با میکروسکوپ روبش الکترونی (SEM) استفاده شد که در این راستا، تصاویر SEM سطوح (الف) CPE برهنه پس از پیش­تیمار الکتروشیمیایی، (ب) CPE/Cys- _۲NSiO، (ج) CPE/₂ NSiO/ i-motif DNA و (د) CPE/Cys-₂NSiO/i-motif DNA درشکل ۵-۲، ارائه شده ­اند. تصویر (الف)، سطح CPE برهنه را بعد از پیش تیمار الکتروشیمیایی در محلول M 5_/0 بافر استات نشان می­دهد. همانطور که مشاهده می­ شود، سطح الکترود خمیر کربن دارای صفحات نامنظم و حفراتی می­باشد که علت آن وجود تخلخل و ساختار پیچیده­ سطح خمیر کربن است. ریخت شناسی سطح برای الکترود خمیر کربن ساده نشان می­دهد که پودر گرافیت در پارافین به خوبی مخلوط شده است. افزایش ناهمواری­ها، سبب افزایش سطح مؤثر الکترود می­گردد که این امر به پخش بهتر و قرارگیری تعداد بیشتری از نانو ذرات کمک می­ کند. تصویر (ب)، توزیع نسبتا یکنواخت از نانو ذرات _۲NSiO، با اندازه قطر متوسط ۳۰ تا ۴۰ نانومتر را نشان می­دهد. در تصویر (د)، ریخت شناسی الکترود بعد از تثبیت DNA را نشان می­دهد. همانطور که مشاهده می­ شود، سطح الکترود CPE₂NSiO، درحضور DNAبه ساختار فشرده تغییر می­ کند. برای بررسی اثرات مولکول L-سیستئین روی DNA تثبیت شده، تصویر SEM در غیاب مولکول -Lسیستئین نیز بررسی شد. در تصویر (ج)، DNA می ­تواند روی سطح الکترود اصلاح شده در غیاب مولکول -Lسیستئین نیز تثبیت شود.
ب
الف

د
ج
شکل ۵-۲- تصاویر SEM سطح (الف) CPE برهنه پس از پیش­تیمار الکتروشیمیایی، (ب) CPE/Cys-₂NSiO، (ج) CPE/₂NSiO/ i-motif DNAو (د) CPE/Cys-₂NSiO/i-motif DNA
۵-۳-۲- مطالعه ولتامتری چرخه­ای چگونگی تثبیت DNA بر روی سطح الکترود اصلاح شده
چگونگی تثبیت کاوشگر DNA بر روی سطح الکترود اصلاح شده بوسیله ولتامتری چرخه­ای در محلول M1_/0 بافر فسفات شامل ^-۴/-۳ [_۶(CN)[Fe M 01_/0 و M NaCl 1_/0 در سرعت روبش ^۱-s mV 50 بررسی شد (شکل ۵-۳). بطوریکه ملاحظه می­ شود، جریان دماغه­های آندی و کاتدی وابسته به زوج اکسنده و کاهنده نشان می­دهد شدت سیگنال ^-۴/-۳ [_۶(CN)[Fe بعد از تثبیت نانو ذرات _۲SiO و L-Cys بر روی سطح الکترود افزایش می­یابد. میزان برگشت پذیری فرایند الکترودی در نتیجه کاهش میزان جدایی پتانسیل دماغه­های آندی و کاتدی (∆E_p) افزایش می­یابد. (منحنی b) دماغه­های آندی و کاتدی وقتی ss-DNA بر روی سطح الکترود اصلاح شده با نانو ذرات _۲SiO قرار می­گیرد، جریان دماغه­های آندی و کاتدی بطور چشم­گیری کاهش می­یابد که نشان می­دهد DNAبر روی سطح الکترود اصلاح شده با نانو ذرات قرار گرفته است (منحنیc). نتایج نشان می­دهد که تثبیت DNA بر روی سطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده، سرعت انتقال الکترون بین گونه­ های الکتروفعال و سطح الکترود را کاهش می­دهد که این امر به دلیل ایجاد دافعه الکتریکی بین بارهای منفی گروه فسفات در ساختار DNA و ^-۴/-۳ [_۶(CN)[Fe می­باشد. اما این رفتار در غیاب-L سیستئین مشاهده نمی­ شود (منحنیd ). در حضور اسید آمینه L- سیستئین مقاومت نانو ذرات _۲SiO برای تثبیت DNA کاهش یافته و تثبیت DNA در این سطح بهتر انجام می­ شود. مولکول L- سیستئین به دلیل تغییرات صورت بندی در اثر فرایند با پروتونه شدن و دپروتونه شدن، متحمل برهم­کنش بین مولکولی می­ شود. وقتی مقدار pH محلول سیستئین پایین­تر از ۰۲_/۵ می­ شود مولکول L-سیستئین بار مثبت پیدا کرده که منجر به افزایش بار مثبت سطح الکترود اصلاح شده در محلول بافر فسفات ۵_/۴= pH می­ شود که این امر می ­تواند به عنوان نیروی اتصالی برای تثبیت DNAاز محلول در نتیجه جاذبه الکترواستاتیکی بین بار منفی فسفات DNA و بار مثبت سطح الکترود عمل کند.
شکل۵-۳- ولتاموگرام­های چرخه­ای محلول^-۴/-۳ [_۶(CN)[Fe M 01_/0 دارای M NaCl 1_/0 در بافر فسفات M1_/0 با ۵_/۴ pH=
در سطح (a) CPE (b) CPE/₂NSiO، © CPE/ _۲ NSiO/ i-motif DNA و (d) CPE/ Cys- _۲ NSiO/i-motif DNA در سرعت روبش ^۱-s mV 50.
۵-۴ –مطالعه رفتار الکتروشیمیایی تاموکسیفن در سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی
برای مطالعه اثرات متقابل تاموکسیفن و DNA i-motifموجود در سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی، از روش­های مختلف الکتروشیمیایی استفاده شد که به آنها می­پردازیم.
۵-۴-۱- ولتامتری چرخه­ای
برهم­کنش تاموکسیفن با DNA i-motif موجود در سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی از ولتامتری چرخه­ای محلول تاموکسیفن در M 1_/0 بافر فسفات دارای NaCl M 1_/0 در ۵_/۴pH= استفاده گردید که در این راستا ولتاموگرام چرخه­ایM ^۵-۱۰ داروی تاموکسیفن موجود در محلول الکترولیت را در سطح الکترودهای مختلف رسم کرده­ایم (شکل ۵-۴).
شکل۵-۴- ولتاموگرام چرخه­ای M ^۵-۱۰ داروی تاموکسیفن در محلولM 1_/0 بافر فسفات با ۵_/۴ pH= دارای M 1_/0 NaCl در
سطحCPE (a) ، (b) CPE/ Cys- _۲ NSiO، © CPE/Cys- _۲ NSiO/i-motif DNA در سرعت روبش پتانسیل ^۱-s mV 50.
بطوریکه ملاحظه می­ شود، منحنی (a)، ولتاموگرام چرخه­ای در CPE برهنه و منحنی (b) ولتاموگرام چرخه
ای درسطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده با Cys-₂SiO را نشان می­دهد. در منحنی (b)، جریان دماغه اکسایش تاموکسیفن در مقایسه با منحنی (a)، به دلیل سطح مؤثر بیشتر ناشی از وجود نانو ذرات _۲SiO در سطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده افزایش می­یابد. منحنی ©، ولتاموگرام چرخه­ای تاموکسیفن را در سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی CPE/Cys- _۲ NSiO/i-motif DNA بعد از تثبیت ساختارDNA i-motif نشان می­دهد. همانطوریکه مشاهده می­ شود، شدت جریان مربوط به اکسایش داروی تاموکسیفن در سطح این زیست حسگر الکتروشیمیایی به شدت افزایش می­یابد که نشان دهنده پیش تغلیظ دارو بر روی سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی می­باشد. از این رو، می­توان اطمینان حاصل کرد که حضور ساختارDNA i-motif بر روی سطح الکترود اصلاح شده، منجر به جذب دارو بر سطح این الکترود و برهم­کنش با ساختار DNA i-motif شده و بدین ترتیب، جریان دماغه اکسایش مربوط به دارو به دلیل پیش تغلیظ آن بر روی سطح این زیست حسگر الکتروشیمیایی افزایش می­یابد.
۵-۴-۲- ولتامتری موج مربعی
از ولتامتری موج مربعی برای اطمینان از اثرات متقابل داروی تاموکسیفن با DNA i-motif ی موجود در سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی استفاده گردید. از اینرو ولتامتری موج مربعی زیست حسگر دارای DNA i-motif، CPE و CPE/Cys/₂ NSiOدر محلول بافر فسفاتM 1_/0 دارای M 1_/0 NaCl در غیاب تاموکسیفن هیچ دماغه­ اکسایش و کاهش نشان نمی­دهند. (ضمیمه شکل ۵-۵- الف) ولتاموگرام­های موج مربعی الکترود اصلاح شده با DNA i-motif در حضور غلظت­های فزاینده­ای از تاموکسیفن (M ^۵-۱۰- M ^۸-۱۰×۷) را نشان می­دهد بطوریکه ملاحظه می­ شود دماغه اکسایش تاموکسیفن در پتانسیل ۱۵_/۱ ولت نسبت به الکترود شاهد ظاهر می­ شود که با افزایش غلظت داروی تاموکسیفن به ارتفاع دماغه اکسایش آن افزوده می­ شود. این نتایج نشان می­دهد که بعد از تثبیت ساختار DNA i-motif بر روی سطح الکترود اصلاح شده، داروی تاموکسیفن موجود در محلول آزمایشی با این ساختار برهم­کنش داده و دماغه اکسایش تاموکسیفن ظاهر می­گردد. در شکل (۵-۵ ب)، نمودار تغییرات جریان دماغه اکسایش تاموکسیفن در سطح زیست حسگر نسبت به تغییرات غلظت آن در محدوده آزمایشی (نمودار معیارگیری) رسم شده است که این نمودار کالیبراسیون برای زیست حسگر ساخته شده بدست آمد. محدوده دینامیک خطی و حد تشخیص از منحنی کالیبراسیون به ترتیب μM 01_/0 تا ۱ و μM 06/0بدست آمد.
شکل۵-۵- ولتاموگرام موج مربعی CPE/Cys- _۲ NSiO/i-motif DNA، در حضور غظت­های فزاینده­ایی از تاموکسیفن:
(a) ^۸-۱۰×۷، (b) ^۷-۱۰، © ^۷-۱۰×۵، (d) ^۷-۱۰×۷، (e) ^۶-۱۰، (f) ^۶-۱۰ ×۵، (g) ^۶-۱۰ × ۷، (h) M ^۵-۱۰، در محلول بافر فسفات ۵_/۴ pH= دارای M 1_/0 NaCl . الف) ضمیمه ولتاموگرام­های موج مربعی: (c , NSiO₂-Cys/CPE (b ,CPE (a CPE/Cys-₂ NSiO/i-motif DNA در غیاب تاموکسیفن. ب) نمودار تغییرات شدت جریان اکسایش تاموکسیفن بر حسب تغییرات غلظت آن.
۵-۵ - اثر pH بر رفتار الکتروشیمیایی تاموکسیفن در سطح
به منظور مطالعه اثر pH بر رفتار زیست حسگر شناور در محلول تاموکسیفن، ولتامتری موج مربعی الکترودCPE اصلاح شده با نانو ذرات _۲ SiOدارای ساختار DNA i-motif، در دو محلول بافر فسفات M1_/0 باpH متفاوت ۵_/۴ و ۰_/۷ در حضور غلظت متفاوتی از تاموکسیفن مورد بررسی قرار گرفت. در شکل (۵-۶ الف)، منحنی­های (a و b) دماغه اکسایش تاموکسیفن در ۵_/۴ pH= را نشان می­دهد. چون ساختار i-motif DNA در این pH پایدار می­باشد. بنابراین، دارو تاموکسیفن با این ساختار اثر متقابل ایجاد کرده که به سطح الکترود جذب می­ شود و دماغه اکسایشی آن مشاهده می­ شود. منحنی­های (c و d)، ولتاموگرام موج مربعی محلول تاموکسیفن در۰_/۷ pH= را در سطح زیست حسگر نشان می­دهد که دماغه اکسایشی بسیار ضعیفی برای داروی تاموکسیفن ظاهر می­سازد. مطالعات نشان می­دهد که با افزایش pH، ساختار DNA i-motif موجود به سطح زیست حسگر پایداری خود را از دست می­دهد و در نتیجه، مانع جذب داروی تاموکسیفن در نتیجه عدم برهم­کنش با DNA i-motif موجود بر بستر زیست حسگر می­گردد. از این رو، هیچ برهم­
کنشی با تاموکسیفن نداشته و دماغه اکسایشی آن مشاهده نمی­ شود.
شکل۵-۶-الف) ولتاموگرام موج مربعی محلول تاموکسیفن با غلظت (a)M ^۴-۱۰ و (b) M^5-10 در بافر فسفات ۵_/۴ pH= در سطح CPE/Cys- _۲ NSiO/i-motif DNA، © نظیر (a) و (d) نظیر (b) در بافر فسفات M1_/0 با۰_/۷ pH= .
برای اطمینان از این بحث، این مطالعه در حضورDNA دو رشته­ای نیز انجام شد. شکل (۵-۶ ب)، ولتاموگرام موج مربعی محلول تاموکسیفن در بافر فسفات با ۵_/۴ pH= و ۰_/۷ pH= در سطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده واجد DNAی دو رشته­ای را نشان می­دهد.
(a-b) dsDNA PH 4.5
(c-d) dsDNA PH 7.0
شکل ۵-۶- ب) ولتاموگرام موج مربعی محلول تاموکسیفن با غلظت (a)M ^۴-۱۰ و (b) M^5-10 در محلول بافر فسفات M 1_/0 با ۵_/۴ pH= در سطح CPE/Cys- _۲ NSiO/dsDNA، © نظیر (a) و (d) نظیر (b) در محلول بافر فسفات M 1_/0 با۰_/۷ pH= .
بطوریکه ملاحظه می­ شود منحنی­های a و b، برهم­کنش بین تاموکسیفن و DNAی دو رشته­ای موجود بر سطح زیست حسگر را در ۵_/۴ pH= نشان می­دهد. نتیجه نشان می­دهد که در pH اسیدی، DNA دو رشته­ای نمی­تواند پایدار باشد و پایداری آن کاهش می­یابد. بنابراین، ساختار DNA i-motif در اینpH تشکیل شده و با داروی تاموکسیفن برهم­کنش کرده و دماغه اکسایشی تاموکسیفن ظاهر می­ شود. در حالیکه در منحنی­های c و d دماغه اکسایش تاموکسیفن کاهش چشم­گیری نشان می­دهد چون ساختارDNA دو رشته­ای در ۰_/۷ pH=پایدار است و از تشکیل ساختار DNA i-motifجلوگیری می­ کند. به دلیل پایداری کم­
تر ساختار DNA i-motifدر این pH و همچنین از برهم­کنش ناچیز داروی تاموکسیفن با ساختار دو رشته­